デジタルPCR (Droplet Digital PCR) 解析
デジタルPCRの受託解析サービスについてはこちら
デジタルPCR (Droplet Digital PCR) 解析リーフレットのダウンロードはこちら をご利用ください。
■デジタルPCRとは
デジタルPCRは従来のリアルタイムPCRに比べてはるかに高精度、高感度に定量を行う新しい技術です。定性のみの通常PCR、検量線による相対定量のリアルタイムPCRに対して、絶対定量を行うデジタルPCRは第3世代のPCRと言われています。
デジタルPCRはリアルタイムPCRと全くコンセプトが異なり、限界希釈(各微小区画にターゲットDNAが1または0となるような希釈)したサンプルDNAを微小区画内に分散させてPCR増幅を行います。これによってターゲット遺伝子を含む微小区画では増幅シグナルがポジティブとなり、ターゲット遺伝子を含まないもしくはサンプルDNA自体を含まない微小区画では増幅シグナルがネガティブとなります。ポジティブの微小区画の数を直接カウントすることでサンプル中のターゲット遺伝子濃度を絶対的に測定します。
限界希釈したサンプルDNAであっても微小区画あたりの断片数が1以上になる場合があります。これを補正するため、ポジティブの数と微小区画の数をポアソン分布にあてはめて最終濃度を算出します。ポアソン分布での補正はソフトウェアにより自動的に算出されます。
ジェネティックラボではドロップレットを自動調製するDroplet Generatorを導入しているため、多検体を再現性良く測定することが可能です。
■Droplet Generatorの仕様
機器名
|
QX200 Droplet Digital PCRシステム
|
販売会社
|
バイオ・ラッド ラボラトリーズ株式会社
|
サンプル容量(μL)
|
20
|
QX200 Droplet Generator
1ランあたりのサンプル処理数
|
1 ~ 96 サンプル
|
サンプル20μLあたりの
ドロップレット数
|
最大20,000
|
励起光源
|
2LED
|
検出器
|
MPPC (Multipixel Photon Counters)
|
検出チャネル
|
FAM (EvaGreen)、HEX (VIC)
|
ダイナミックレンジ
|
5オーダー
|
精度
|
±10%
|
読み取り区画数
|
10,000以上/サンプル
|
QX200 Droplet Generator サイズ
(W x D x H)
|
28 x 36 x 13 cm (11 x 14 x 5")
|
QX200 Droplet Reader サイズ
(W x D x H)
|
66 x 52 x 29 cm (26 x 20 x 11")
|
QX200 droplet reader capacity
|
1-96 samples
|
■ddPCRの特長
絶対定量 |
|
高精度 |
|
高感度 |
|
高処理性 |
|
■デジタルPCRのアプリケーション
- CNV(Copy Number Variation)
-
Rare mutation / Rare sequence 検出
-
mRNA、 miRNA 定量(高精度定量、低コピー数定量)
-
Single cell など、微量サンプルでの定量
■ワークフロー
1. ドロップレットの作成
- 専用カートリッジに調製したサンプルおよび専用オイルを分注します。
- カートリッジをセットした後、サンプルを微小区画に分割します。
- ターゲットDNAとバックグラウンドDNAがランダムに分散します。
2. PCR
- 専用カートリッジの各ウェルで作成したドロップレットを、96ウェルのPCRプレートの各ウェルに移し、シーリングを行います。
- その後、それぞれの微小区画で個別にPCR反応を行います。
3. ドロップレット蛍光測定およびデータ解析
- PCR終了後、96ウェルPCRプレートをQX200 Droplet Readerにセットします。
- 各ウェル内のドロップレットの蛍光を測定し、ポジティブな微小区画の数およびネガティブな微小区画の数を直接カウントします。
- QuantaSoftソフトウェアを使用し、ポジティブな微小区画の割合からターゲットの濃度(コピー/μL)を算出します。
【バイオ・ラッド社の製品紹介ページ】http://www.bio-rad.com/ja-jp/category/digital-pcr
https://ls.ipros.jp/advertising/detail/33462/
■使用プローブ
- リキッドバイオプシーに対応して開発されたプローブが使用可能です。
- QX200システムに対して開発されたプローブのため、全てワーク確認済みです。
- Singleplex用のプローブを用いたtypingだけでなく、Multiplex用のプローブを用いたtyping、ホットスポットに対するプローブを用いたScreeningが可能です。
- 対象がん種に対して薬剤感受性または耐性変異の検出が可能です。変異のモニタリングに最適です。
【変異解析用プローブ】
対象組織 | 遺伝子 | 対象変異 | 検出 |
Lung | ALK | p. E17K | single |
p. T1151_L1152insT | single | ||
p. L1152R | single | ||
p. C1156Y | single | ||
p. I1171T | single | ||
p. F1174L | single | ||
p. V1180L | single | ||
p. L1196M | single | ||
p. G1202R | single | ||
p. S1206Y | single | ||
p. G1269A | single | ||
p. L1198F | single | ||
p. T1151_L1152insT, p. C1156Y, p. L1196M, p. G1269A |
multi | ||
p. L1152R, p. F1174L, p. V1180L |
multi | ||
p. I1171T, p. G1202R, p. S1206Y |
multi | ||
EGFR | p. L858R | single | |
p. T790M | single | ||
p. C797S (c.2389T>A, c.2390G>C) |
multi | ||
p. G719C/A/S | multi | ||
Exon19 Deletion | screening | ||
PIK3CA | p. E542V/K, p. E545V/G/A/Q/K, p. Q546L/R/P/E/K |
screening | |
p. H1047L/R/Y, p. G1049R/S |
screening | ||
ROS1 | p. G2032R | single | |
Brest | ESR1 | p. Y537N | single |
p. Y537S | single | ||
p. D538G | single | ||
p. E380Q | single | ||
p. Y537N/S, p. D538G | multi | ||
p. V534E, p. P535H, p. L536R/Q/P/H, p. Y537N/C/S, p. D538G |
screening | ||
ESR1/YAP1 fusion | expression | ||
PIK3CA | p. E542V/K, p. E545V/G/A/Q/K, p. Q546L/R/P/E/K |
screening | |
p. H1047L/R/Y, p. G1049R/S |
screening | ||
Melanoma | BRAF | p D549G/N, p. K601E, p. V600E/K/R/G/M/D |
screening |
NRAS | p. Q61R/K/L?H/P/E, p. E62K |
screening | |
MEK1 | p. C121S, p. P142S/L, p. G128V/D, p. F129L |
screening | |
Other | AR | AR v7 | expression |
EGFR | p. S492R (c. 1474A>C) | single | |
EGFR | p. S492R (c. 1476C>A) | single | |
SMO | p. D473H | single |
【CNV解析用プローブ】
対象遺伝子 | reference | ||
AKT1 | CTNNB1 | IGF2R | AP3B1 |
AKT2 | EGFR | KIT | APOB |
ALK | ESR1 | KRAS | AQP5 |
AR | FGFR1 | MEK | PMP22 |
BRAF | FGFR2 | NRAS | RPP30 |
CCND1 | FGFR3 | PDGFRA | TOP3A |
CDK4 | HER2 | PIK3CA | - |
CDK6 | IGF1R | VEGFR | |
cMET | - |
※表にないターゲットについても対応可能な場合がございますので、ご検討内容をお問い合わせください。
■リーフレットのダウンロード
デジタルPCR (Droplet Digital PCR) 解析リーフレットのダウンロードはこちら をご利用ください。
なお、本件に関するお問い合わせは、お問い合わせフォームよりお願いいたします。