マイコプラズマ否定試験の受託試験
バイオ医薬品や再生医療等製品の研究開発や製造を行っているメーカーで、次のようなことをお考えではないでしょうか。
- 国内での上市予定の製品に対して、日本薬局方（JP）に準拠したマイコプラズマ否定試験を迅速に実施したい
- 米国や欧州での上市予定の製品に対して、各ガイドラインに準拠したマイコプラズマ否定試験を迅速に実施したい
- 医薬品製造、又は細胞培養の工程内でマイコプラズマ否定試験を実施したい
ユーロフィン分析科学研究所では、GMP省令準拠で管理された分析機器を用いて、マイコプラズマ否定試験（核酸増幅法：NAT）のバリデーションから、実測定、技術移転までトータルで実施可能です。
近年、ヒトや動物細胞を利用した細胞培養技術は、抗体やワクチンだけでなく、再生医療や遺伝子治療の分野まで、幅広く利用されています。
医薬産業政策研究所「バイオ医薬産業の課題と更なる発展に向けた提言」（リサーチペーパー・シリーズNo.71）によると、Phase I以降の抗体、ワクチン、細胞治療、遺伝子治療等の開発品目は、1995年の300品目程度に対し、2018年では2000品目を超え、年々増加傾向にあります。
これらバイオテクノロジー応用医薬品／生物起源由来医薬品に対し、各国の規制当局はマイコプラズマ否定試験の実施を要求しています。
マイコプラズマは、自然界に広く存在する微生物で、感染すると細胞の成長や代謝に悪影響を及ぼします。
マイコプラズマは非常に微小であるため、これら医薬品の製造過程において不純物除去フィルターを通過し、医薬品に混入するリスクがあります。そのリスクを避けるため、マイコプラズマ否定試験による安全性の確認が必要とされています。
マイコプラズマ否定試験の概要
第十七改正日本薬局方 参考情報「バイオテクノロジー応用医薬品／生物起源由来医薬品の製造に用いる細胞基材に対するマイコプラズマ否定試験」では、次の3つの試験方法が挙げられています。
- A．培養法
- B．指標細胞を用いたDNA染色法
- C．核酸増幅法（Nucleic acid amplification: NAT）
対象検体は、マスター・セル・バンク、ワーキング・セル・バンク、医薬品製造工程中の培養細胞です。これらに対して、A法又はB法を実施します。ただし、適切なバリデーションを実施することで、C法を代替法として利用できます。
A法では、まず、検体をカンテン平板培地で、35～37℃で14日間以上培養します。その後、検体（細胞懸濁液）を、液体培地を入れた容器に接種し、35～37℃で培養します。
培養開始後、2、3日ごとに観察し、液体培地の色調が変化した日、色調の変化がない場合には3日目、7日目及び14日目の計3回にわたり、液体培地から採取しカンテン平板培地に接種します。
35～37℃で14日間以上培養し、7日目と14日目に顕微鏡でマイコプラズマの集落の有無を調べます。
B法では、カバーガラスを沈めた培養ディッシュに指標細胞（Vero細胞）を接種し、一日増殖後、検体を接種します。試験には、陰性対照と2種類のマイコプラズマ陽性対照を置きます。35～38℃で3日～6日間培養します。
カバーガラス状の培養細胞を固定後、染色剤によりDNA蛍光染色し、蛍光顕微鏡でマイコプラズマの存在を確認します。
陰性対照と陽性対照と検体を比較しマイコプラズマ汚染の有無を判定します。
C法（核酸増幅法：NAT）は、検体から抽出した核酸をマイコプラズマに特異的なプライマーやプローブを用いて増幅し、マイコプラズマに由来する核酸の存在の有無を高感度に検出できる方法です。
NATは目的とする塩基配列の存在を示すもので、必ずしも生きたマイコプラズマの存在を意味するものではありません。
NATは特定の手法が規定されておらず、特異性、検出感度、頑健性のバリデーションを実施し、その妥当性が立証されるならば、どのような手法を用いても良いとされています。
一般に、C法の実施では、陽性対照（生菌）と陰性対照を置き、検体からマイコプラズマの遺伝子が増幅されないとき試験適合となります。
A法とB法のマイコプラズマ否定試験の課題は、試験期間が長いことです。少なく見積もってもA法では28日以上、B法でも4日以上必要です。
市場で需要の高いバイオ医薬品を早期にリリースしたくても、この試験期間を短縮することはできません。また、製造現場において実施される、マイコプラズマ汚染の検知や封じ込めを目的とした中間体の工程内スクリーニング試験の大きな足かせになります。
そのため、迅速に結果が得られるC法（NAT）が主流になりつつあります。当社ではこの手法を提供しています。
当社でのマイコプラズマ否定試験（C法：NAT）のワークフローを紹介します。
お客様から検体を提供していただき、各国のガイドラインやお客様の検体に合わせ、特異性、検出感度、頑健性など必要なバリデーションを実施します。
また、実測定の陽性対照とするマイコプラズマ（生菌）とコントロールDNAの相関データも取得します。
測定には、主にミネルバ・バイオラブス社「Venor®GEM qEPマイコプラズマ検出キット」を用いた定量リアルタイムPCR（qPCR）を使用します。
当キットは、マイコプラズマの16S rRNA翻訳領域を増幅し、測定波長520 nm（FAMチャンネル用）で特異的に検出されます。
同時に、検体にはインターナルコントロールが添加されており、PCR反応を阻害する物質が含まれているか否かの検証も行われます。
当キットは、第十七改正日本薬局方マイコプラズマ否定試験に準拠、欧州薬局方EP2.6.7に登録されている全てのマイコプラズマを一度に検出できます。
試料調製や操作も簡便で、おおよそ4.5～6.5時間で結果が得られます。
実測定では、バリデートされた試験方法で、生菌を使用せずコントロールDNAを陽性対照として測定します。
＜測定結果例：増幅曲線＞
［赤：マイコプラズマ（520 nm）、青：インターナルコントロール（610 nm）］
技術移転では、お客様のラボや製造現場においてスムーズに測定をできるようにサポートします。
お客様の研究開発の規模や必要性に応じて、下記の3通りで、マイコプラズマ否定試験サービスを利用できます。
- バリデーション+実測定
- バリデーション+実測定+技術移転
- バリデーション+技術移転
例えば、10回未満の製造の臨床研究や小規模な臨床試験で利用する場合、「バリデーション+実測定」のご依頼、医薬品のリリースまで十分に時間があり、試験は社内で実施したい場合は「バリデーション+技術移転」のご依頼とアレンジできます。
ユーロフィン分析科学研究所に依頼するメリット
- ユーロフィンBPTネットワークとして、マイコプラズマ否定試験に20年以上の実績
- 技術移転後にコントロールDNAを用いた手法で、低リスク・低コストで試験実施可能
- フィジビリティスタディ（Feasibility Study）のみのご依頼も可能
- GMP 省令準拠で管理された分析機器を保有
ユーロフィンBPT（BioPharma Product Testing）ネットワークは、培養法を含め長年マイコプラズマ否定試験に力を入れており、海外での規制当局への承認実績、及びノウハウの蓄積といった強みがあります。
当社では、これらのノウハウを活用してマイコプラズマ否定試験を組み立て、最適な試験デザインを提案します。
当社では、試験法のバリデーションおいて、マイコプラズマ生菌とコントロールDNAの相関データを取得し、お客様に提供します。
お客様のラボや製造現場において、マイコプラズマ生菌を使用する場合、細胞へのコンタミネーションを回避する対応が必要です。一方、コントロールDNAを用いた試験では、それらの対応は不要となります。
そのため、技術移転後、お客様のラボや製造現場では、低リスク・低コストでマイコプラズマ否定試験を実施可能であるというメリットがあります。
当社では、バリデーションの前段階である「フィジビリティスタディ」のみのご依頼も受託可能です。お客様のサンプルで、問題なくマイコプラズマ否定試験が実施できるかどうかを検証することができます。
サンプルによっては、その特性や夾雑物によって、測定できない可能性があります。これらを開発初期段階で調査することで、製造方法などの改善に役立てることができます。
当社は、GMP省令に準拠した組織を構築しています。その運営下で、プロトコルの作成、試験、サンプルの保管、施設・機器・システムの管理を実施しています。
ユーロフィン分析科学研究所では、GMP省令準拠で管理された分析機器を使って、JP、EP、USPなど各国ガイドラインに準拠した、マイコプラズマ否定試験のバリデーションから、実測定、技術移転までトータルで実施可能です。
マイコプラズマ否定試験をお考えであれば、ぜひ当社をご活用ください。ご質問やご相談は、お気軽にお問い合わせください。
